Актуалноназад

15.06.2011

В МДЛ МЕДИЛАБ-Благоевград е внедрeна PCR апаратура и методи за ДНК и РНК анализи чрез PCR/ПВР технология.----------------------------НАУЧЕТЕ ПОВЕЧЕ>

Полимеразната верижна реакция-ПВР (Polymerase Chain Reaction- PCR) е метод за лабораторна диагностика, създаден с цел идентифициране на причинители на инфекциозни заболявания директно в биологичен материал. Това е високо чувствителен и специфичен метод , който улавя дори и минимални количества нуклеинова киселина в изследвани биологичен материал. PCR – методът е разработен от Кери Мулис – световен авторитет в биохимията, удостоен с Нобелова награда за това свое постижение.  Този метод се използва основно за научни цели, но навлиза бързо и в медицинската практика.Поради това , че PCR  е скъпоструващ и много трудоемък метод за oпределяне на НК на инфекциозен причинител, все още се използува в инфектологията предимно за търсене на генетичен материал при бактерии, труднорастящи или нерастящи в хранителни среди – хламидии, микоплазми, легионели, бруцели,туберкулозни бактерии и т.н , не размножаващи се в клетъчни култури вируси – папиломни вируси ( HPV),полиомни вируси, хепатитни вируси ( HBV , HCV) , човешкия имунодефицитен вирус(HIV). херпесни вируси ( CMV, EBV,HSV),  а също така микроорганизми, причиняващи особено опасни инфекции и др.  Принципа на метода се състои в ензимното ин витро намножаване(амплификация) на специфични фрагменти от нуклеиновата киселина(вирусна, бактериална, протозойна гъбична и т.н). Това се постига чрез използването на двойка специфични праймери, които се прикрепват за уникални консервативни участъци на двете нуклеотидни вериги . PCR  протича циклично в три основни етапа: последователно редуване на денатуриране  на НК, свързване на праймерите към съответните им участъци и изграждане на амплификационния продукт. Преминаването от един етап в друг става чрез смяна на температурата.Чрез повтаряне на циклите може да се постигне до и над милионкратно увеличение на желания фрагмент. Доказването на получените чрез PCR амплифицирани продукт се визуализират основно по два начина: чрез агарозна или полиакриламидна гелелектрофореза или чрез хибридизационни методи Southern blot ,Dot blot или имуноензимна реакция ELISA. Съществуват различни варианти на PCR: 

    1.RT-PCR ( PCR с обратен презапис) – използува се за амплификация на RNA-вируси( арбовируси,  HIV,HCV и др.). Тъй като  в PCR  се работи само с DNA, при посочените по-горе вируси преди същинската полимеразно-верижна реакция трябва да се синтезира комплементарна DNA с ензима обратна транскриптаза.

    2.Nested PCR- провеждат се две последователни PCR-и.Специфичността се повишава тъй като всички продукти, които са неспицифично амплифицирани при  първата реакция не се амплифицират по време на втората реакция. Използува се при проби с нисък брой копия( очни херпесни вируси, аденовируси, цитомегалвируси и др.)

    3. Multiplex PCR – представлява едновременно амплифициране на повече от една таргетна секвенция при използване на няколко специфични праймерни двойки. Могат да се използват най-много пет праймерни двойки. Необходимо условие всички праймерни двойки да имат еднаква или близка точка на топене, за да може свързването им към таргета да става едновременно. Например при HPV амплификацията на няколко таргета позволява бързо разграничаване на нискорисковите HPV – 6, 11 от високо рисковите HPV 16, 18. Oсвен това се използва при едновременното търсене на два вируса(HSV1 и HSV2 ) или на вируси и бактерии ( HSV, хламидия и гонорея ).

    4. Real-time PCR –базира се на детекция и количествено определяне на флуоресцентното излъчване по време на амплификацията, което е право пропорционално на количеството образувани амплификони. Това дава възможност за директно наблюдение на кумулирането на амплифицирани продукти в реално време. Realtime PCR  позволява осъществяването на най-фини качествени и количествени анализи на експресията на различни гени, анализ на точкови мутации и т.н .

   5.In situ PCR- използува се за откриване на минимални количества вирусна DNA или RNA в тъканни срези или интактни клетки Тук не се налага екстракция на DNA и реакцията се провежда директно в клетката. Това дава възможност както за детекция и типиране напр. на HPV, така и за точна локализация на вируса в клетката. Визуализацията се осъществява със светлинен микроскоп.

 

   Апаратът за молекулярна диагностика, с който разполага медико-диагностична лаборатория Медилаб притежава Aladin FEP многоканален флуоресцентен детектор.Отчитането на PCR амплификацията се осъществява без агарозна електрофореза. Към апарата има софтуер- -отчитане, интерпретация и съхранение на резултатите в база данни.Резултата е качествен –ДА/НЕ. Повечето китове са базирани на едновременна амплификация (мултиплексен PCR) на специфичен регион от патогенния геном с помоща на двойка или тройка специфични праймери – при HPV , при Mycoplasma hominis/Gardnerella vaginalis, при Chlamydia trachomatis/Ureaplasma urealyticum/Mycoplasma genitalium в клинични материали(цервикални секрети, урогенитални проби, проби от урина, секрет от простата, и др.).При флуоресцентния PCR aмплифицирания продукт се детектира като се използват флуоресцентни багрила. Тези багрила обикновенно се прикрепват към олигонуклеотидните проби, които се свързват специфично към амплифицирания продукт по време на амплификацията.Многоканален роторен тип флуориметър е създаден специално за детекция на флуоресцентния сигнал след амплификацията.

  Другите два кита, с които разполага лабораторията са за доказване HBV-DNA и HCV-RNA в кръвна плазма от болен. Откриването на НК на тези вируси е от особено значение в случите, когато има клинични данни за заболяване ,а не се откриват никакви или ограничени маркери на инфекцията.Доказването на генетичен материал от тези вируси би помогнало на клинициста да постави точна диагноза и проведе навременно и правилно лечение.